Tlen to lekki, nadający się do oddychania gaz, którego Duplicants potrzebują do przeżycia. Unosi się nad cięższymi gazami, takimi jak Dwutlenek Węgla, a Duplicants mogą nim oddychać tylko w użytecznym zakresie ciśnienia: poniżej 50 g/kratkę nie nadaje się do oddychania, natomiast między 50 a 300 g/kratkę nadaje się do oddychania, ale nadal stresuje Duplicants. Typowy Duplicant zużywa 100 g/s, a kilka cech zmniejsza lub zwiększa to zapotrzebowanie. Jeśli Duplicant nie może oddychać, wstrzyma oddech, przerwie pracę i pobiegnie po tlen; jeśli wskaźnik oddechu się opróżni, udusi się.
Tlen jest jednym z najważniejszych zasobów wczesnej i środkowej fazy gry, ponieważ wiele systemów zależy od niego bezpośrednio. Atmo Suits, Jet Suits, Oxygen Masks i Dok Skafandrów Ołowianych wymagają Tlen do uzupełniania swoich skafandrów, a Teleskop również potrzebuje Tlen do działania. Jest też używany w Rafineria Oksylitu, który przekształca Tlen i Złoto w Oksylit w tempie 600 g/s Tlen oraz 3 g/s Złoto na 600 g/s Oksylit. W gospodarce stworzeń Puft Princes i Dense Pufts mogą oddychać Tlen i wydalać Oksylit, podczas gdy Longhair Slicksters zużywają go w dużych ilościach i zapewniają mobilne Wystrój.
Istnieje wiele sposobów produkcji Tlen. Do najczęstszych należą Dyfuzor Tlenu z Glon, Elektrolizer z Woda, Terrarium Glonów z Woda i Glon, Paprotka z Dwutlenek Węgla oraz Odtleniacz Rdzy z Rdza i Sól. Środek dezodoryzujący również przekształca Zanieczyszczony Tlen w Tlen, używając Piasek lub Regolit. Naturalny Oxylite emituje Tlen, a skupisko w pobliżu Kapsuła Drukująca zapewnia trochę przestrzeni do oddychania we wczesnej fazie, przez pierwszych kilka cykli. Tlen można też pozyskiwać z niektórych odnawialnych kosmicznych POI w formie stałej lub gazowej.
Tlen bywa przydatny również w bardziej wyspecjalizowanych zastosowaniach. Po schłodzeniu do Płynny Tlen staje się mocnym utleniaczem rakietowym dla Silnik Naftowy i Silnik Wodorowy. Nie jest najlepszym medium do szybkiego przenoszenia ciepła, ale sprawdza się w powolnych obiegach wymiany ciepła, ponieważ może bezpiecznie mieszać się z otaczającym Tlen, jeśli rurociąg zostanie otwarty do konserwacji, co ułatwia pracę z nim w porównaniu z wieloma innymi gazami. W takich przypadkach standardową konfiguracją są Radiant rury przy źródle i odbiorniku ciepła.
Tlen jest często preferowany w infrastrukturze bazy, ponieważ występuje obficie i łatwo go rozprowadzać.
Używanie Tlen w obiegu jest wygodne podczas konserwacji, ponieważ każdy wyciekły gaz po prostu miesza się z otaczającym Tlen.
Płynny Tlen to istotna forma w późnej fazie gry, gdy potrzebne jest magazynowanie wysokowydajnego utleniacza rakietowego.
Główną wadą jest to, że produkcja Tlen musi nadążać za zapotrzebowaniem Duplicants, zwłaszcza w miarę rozwoju kolonii.
